Plateforme d'imagerie cellulaire et moleculaire NeurImag

NeurImag est une plateforme située au deuxième étage de l'Institut de Psychiatrie et de Neurosciences de Paris (IPNP).
Les Neurosciences sont au coeur des sujets de recherche à l'IPNP.

NeurImag est pleinement dans le développement et l’implémentation de nouvelles méthodes et techniques pouvant aider à la réalisation de projets dans le domaine des Neurosciences. Nous avons entrepris de faciliter l’accès aux techniques de super-résolutions, mais aussi d’implémenter des techniques de photomanipulation et enfin d’apporter une solution à l’imagerie en profondeur à travers l’apport des méthodes de clarification.

La plateforme NeurImag propose deux types d’activités :

Le service d’imagerie qui a pour but d’aider et de proposer des solutions aux scientifiques internes et externes dans le domaine de la microscopie de fluorescence mais aussi dans le traitement et l'analyse d'images pour leurs projets de recherche.

Le service de culture primaire de neurones permettant ainsi aux utilisateurs d’avoir les échantillons biologiques sur place.

Lydia Danglot (Ph.D., Directrice Scientifique), Sylvain Jeannin (IE), Laurianne Beynac (IE), Philippe Bun (Ph.D., IR) et David Boulet (IE, Responsable culture) assurent le bon fonctionnement de la plateforme NeurImag.

La plateforme de culture primaire de neurones offre des prestations allant de la culture de neurones primaires aux transfections et tests de molécules. Les manipulations se font exclusivement au laboratoire de confinement 2.
Des prestations d’immunomarquages sont également proposés et réalisées dans l’Institut pour être ensuite visualisés sur les systèmes de NeurImag.

Un contrôle de qualité est réalisé trimestriellement par le service afin de garantir le protocole de culture.

La plateforme d’imagerie propose des systèmes de microscopie couvrant une large gamme de techniques de microscopie, allant de la vidéo-microscopie à l'imagerie à super-résolution (PALM, STORM, STED 3D et SIM).

En plus des techniques de microscopie, la plateforme d’imagerie NeurImag peut vous apporter des solutions quant aux traitements et à l’analyse de vos images.

Actuellement la plateforme d’imagerie est composée de 4 systèmes de microscopie avancée et de deux stations d'analyse d'images.
Les deux stations de travail sont disponibles si vous souhaitez utiliser les logiciels suivants : FIJI, Volocity, Neurolucida, Icy et Zen Blue
La plateforme forme aussi les utilisateurs sur les systèmes afin qu’ils puissent mener leurs études en toute autonomie en bénéficiant de l’expérience des ingénieurs.

Si vous souhaitez discuter d’une éventuelle collaboration ou tout simplement vous renseigner sur les services de la plateforme, nous vous invitons à nous contacter en cliquant sur le lien suivant : NeurImag.

L'équipe

Sylvain Jeannin

Philippe Bun

Lydia Danglot

Laurianne Beynac

Contacter la plateforme

Plan de la plateforme

Le schéma ci-dessous vous aidera à vous orienter quant au choix le plus adapté pour imager vos échantillons biologiques. Les systèmes et/ou techniques mentionnées sont disponibles sur la plateforme.
Pour plus de détails, veuillez contacter l’équipe de la plateforme à l’adresse suivante : neurimag.ipnp@inserm.fr

NeurImag est une des quatre plateformes technologiques que comptent l’Institut de Psychiatrie et de Neuroscience de Paris (IPNP). Les missions principales de la plateforme d’imagerie NeurImag sont :

SOUTIEN aux scientifiques de l’IPNP, d’équipes de recherches externes et d’industriels dans la préparation d’échantillon jusqu’à l’acquisition d’images en microscopie optique
Mots-clés : Conseils techniques, Sélection et Formation en microscopie optique, Préparation de cultures primaires, Gestion de projets, Réunion et Bilan, Traitement-Analyse-Visualisation des Images, Transfert et Stockage des données.

ENTRETENIR ET PROPOSER des systèmes de microscopie de fluorescence dite « conventionnelle » et avancée :

- Section optique :

Microscopie Wide-field (pas de section) et Confocal à balayage
Microscopie Spinning-disc et Swept-field
Microscopie Total Internal Reflection (TIRF)

- Suivi d’intéractions et de dynamique moléculaire et subcellulaire :

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)
Forster Resonance Energy Transfer (FRET)
Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM)
Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

- Suivi à haute resolution spatiale et/ou temporelle :

Microscopie spinning-disk dual-view simultanée
Microscopie confocale Airyscan (et Fast Airyscan)
Microscopie à Illumination Structurée 3D (SIM)
Microscopie à épuisement d’émission stimulée 3D (STED)
Microscopie de Localisation de Molécule (PALM*, 3D dSTORM**)
*PhotoActivated Localization microscopy, **direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

- Photo-manipulation :

Photo-ablation, Photo-activation, Photo-décageage

APPORTER des solutions en Traitement, Analyse et Visualisation des données :

- Logiciels libres et commerciaux complémentés par l’écriture de macros/plugins à façon

SOUTIEN scientifique à la préparation d’échantillon biologique

- Préparation et Maintenance :

Lignées immortelles commerciales
Culture primaire de cellules (Neurones d’hippocampe et de cortex, cellules gliales et microgliales)

- Développement et Optimisation des protocoles d’imagerie:

Méthodes de transfection
Fixation et Marquage par colorant et/ou anticorps

ORGANISER ET ANIMER des ateliers en Imagerie sous les tutelles de l’Inserm, du CNRS, de l’Univ. Paris et l’Univ. PSL), des travaux pratiques vers le grand public et des cours pour un public plus averti, participer à l’évaluation de nouvelles techniques avec nos partenaires industriels

Pour toute assistance ou précisions concernant les services disponibles sur la plateforme, veuillez contacter l’équipe à l’adresse suivante : neurimag.ipnp@inserm.fr

L’équipe vous contactera au plus vite pour vous proposer un entretien (en présence ou à distance) pour discuter de vos besoins en Imagerie (Préparation d’échantillon, Microscopie, Analyse des données) afin de répondre au mieux à vos problématiques.
Les détails de chaque système/services sont disponibles dans l’onglet Systèmes et Culture respectivement.

Conventional fluorescence imaging

	Widefield fluorescence microscopy
	Laser scanning confocal microscopy
	Spinning disc confocal system
	Video microscopy and slide scanner system
	Swept-field confocal system

Advanced fluorescence techniques

	Total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF)
	Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)
	Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy (FCCS)
	Fluorescence lifetime Imaging microscopy (FLIM)
	Fluorescence resonance energy transfer (FRET)
	Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)
	Laser ablation and Photon uncaging

Super resolution fluorescence techniques

	Structured Illumination Microscopy (SIM)
	Stimulated Emission Depletion microscopy (STED)
	Photoactivated localization microscopy (PALM)
	Stochastical Optical Reconstruction Microscopy (STORM)

Data and Image Analysis

	Image Deconvolution
	Workstation for data processing and analysis (open sources freeware)
	Data analysis custom made solution
	Workstations for data processing and analysis
	(commercial software)

Primary cells

	Hippocampus neurons
	Cortical neurons
	Glial cells
	Microglial cells

Sample preparation

Coating of glass coverslip

Transfection

Immunostaining

Medium

Conditioned medium

Glial cells medium

Leica SP5 STED CW

Leica SP8 STED 3X

Zeiss LSM880 - Elyra PS1

Leica - Spinning disk X1

Zeiss Axioplan 2

Zeiss widefield scanner

Bruker Vutara

Stations de travail

Réservations

Services additionnels

Phaseview - Lightsheet Alpha3

Bruker - Biphoton Ultima 2P plus

Leica SP5 STED CW

Microscope confocal inversé à balayage laser avec contrôle de l'environnement, laser visible (Argon, 561nm et 633 nm), trois modules photomultiplicateurs (PMT), 1 détecteur hautement sensible (HyD), platine motorisée XY, positionnement piézo-électrique de l'axe Z et scanner résonnant (8 kHz). Module STED CW avec un laser de depletion à 592 nm.

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES

Interface logicielle conviviale et intuitive pour une utilisation immédiate.
Le microscope est entièrement fermé et équipé d'un système de chauffage et d'un mélangeur de gaz CO2 (Life Imaging Services).
La détection est faite avec 3 PMTs, dont un pour l'imagerie en lumière transmise et 1 détecteur hybride hautement sensible.
Le microscope est équipé d'un scanner résonnant (8 kHz) pour l'imagerie confocale rapide.

FONCTIONNALITÉES AVANCÉES

En plus d'une interface logicielle intuitive et compacte rendant l'imagerie confocale facile dès sa première utilisation, des expériences nécessitant l’utilisation des techniques de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching ou Redistribution de fluorescence après photoblanchiment) ou de FRET ratiométrique (Fluorescence / Förster Resonance Transfer Energy ou Transfert d’énergie par resonance de type Förster) peuvent être réalisées sur ce microscope. L'imagerie en mode Multi-position et Tile Scan sont également disponibles.

OBJECTIFS DISPONIBLES

LASERS

FILTRES DICHROÏQUES POUR L’OBSERVATION ET L’ACQUISITION

Pour l’observation (aux oculaires):

Pour l’acquisition:
Technologie basée sur la séparation des faisceaux par onde acousto-optique (en Anglais, AOBS pour Acousto-Optical Beam Splitter) qui permet une détection des longueurs d’onde d’émission sans le recours aux filtres dichroïques d’émission.

DÉTECTION

3 modules photomultiplicateurs (PMT) dont 1 dédié pour l’imagerie en lumière transmise (t-PMT pour transmitted photomultipliers)
1 détecteur hautement sensible (HyD)

TECHNIQUE DE SUPER-RESOLUTION

STED pour STimulated Emission Depletion (en Français, Déplétion par émission stimulée ici avec un laser de déplétion continue à 592 nm) est une technique de super-résolution qui permet de s’affranchir de la limite de diffraction et ainsi d’obtenir une résolution latérale (respectivement axiale) allant jusqu’à 50 nm (respectivement 200 nm). Brièvement, cette technique repose sur la superposition de deux lasers : le premier consiste à exciter un volume de l’échantillon tandis que le second (décalé vers le spectre des longueurs d’onde « rouge ») excite la périphérie du volume pour « éteindre » la fluorescence par émission stimulée. Sur le SP5, ce second laser dit «de déplétion » est continu et a une longueur d’onde de 592 nm. Il est courant de parler de donut pour se référer à la forme du faisceau de déplétion sur l’échantillon. En conséquence, le volume d’excitation de l’échantillon peut être réduit à un point focal dont la taille qui peut être réglée par l’intensité du laser de déplétion définit la résolution. Sur ce système en particulier, l'utilisation d'un laser de déplétion continue à 592 nm doit être combinée à une détection dite par fenêtre temporelle (en Anglais, gated detection) pour améliorer encore la résolution. Nous vous recommandons donc d'utiliser le LEICA SP8 - STED 3X pour obtenir la meilleure résolution possible. Notez que l'imagerie super-résolution STED requiert l’utilisation d’une puissance laser élevée pour induire une émission stimulée ce qui peut endommager les échantillons. Enfin cette technique nécessite une préparation en amont : un milieu de montage spécifique et l’utilisation de certains fluorochromes afin d’améliorer l'efficacité de l'imagerie STED.
Pour plus d’informations sur cette technique, nous vous recommandons les liens suivants: iBiology STED, Leica STED3X et Leica sample preparation recommandation.

AUTRES

La plateforme d’imagerie Neurimag met à votre disposition des chambres adaptées Chamlide pour l’imagerie avec des échantillons vivants.

Échantillons recommandés : Échantillons fixes et vivants, Imagerie confocale rapide, Imagerie haute-résolution.

Pour plus d’information, n’hésitez pas à contacter les membres de la plateforme Neurimag.

Retour

Leica SP8 – STED 3X

Microscope confocal inversé à balayage équipé d’un laser à lumière blanche, de 2 détecteurs à fenêtre temporelle (en Anglais, gated detection) hautement sensibles (HyD) pour l’imagerie STED en 3 couleurs (laser de déplétion continue à 592 nm et pulsée à 775 nm).

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES

Interface logicielle innovative pour l’imagerie confocale grâce au module Navigator.
Le système est équipé d’un laser à lumière blanche, d’une diode laser UV et d’un laser Argon permettant l’utilisation simultanée de 14 lasers si besoin.
La détection s’appuie sur deux modules photomultiplicateurs (PMTs) mais également de deux détecteurs hybrides à fenêtre temporelle. Pour l’imagerie confocale, ces détecteurs permettent de réduire la détection de l’autofluorescence et d’éventuelles réflexions.
Le système dispose d’un objectif 93x à immersion dans le glycérol (300 µm de distance de travail) qui comprend une bague de correction motorisée, utile pour l’imagerie d’échantillons épais.
Le mode Lightning apporte une solution de déconvolution adaptative en temps réel sur des images confocales mais aussi de super-résolution STED.

FONCTIONNALITÉES AVANCÉES

OBJECTIFS DISPONIBLES

* correction motorisée disponible
** cet objectif n’est pas installé sur le système. Veuillez contacter l’équipe Neurimag si vous avez besoin.

LASERS

FILTRES DICHROÏQUES POUR L’OBSERVATION ET L’ACQUISITION

Pour l’observation (aux oculaires):

DÉTECTION

2 modules photomultiplicateurs (PMTs)
2 détecteurs à fenêtre temporelle hautement sensibles (HyD) qui permettent la détection et la discrimination des photons suivant leur temps d’arrivée mais aussi de limiter la détection de la réflexion à la lamelle

TECHNIQUE DE SUPER-RESOLUTION

STED 3D pour STimulated Emission Depletion (en Français, Déplétion par émission stimulée ici avec un laser de déplétion continu à 592 nm et pulsée à 775 nm) est une technique de super-résolution qui permet de s’affranchir de la limite de diffraction et ainsi d’obtenir une résolution latérale (respectivement axiale) allant jusqu’à 50 nm (respectivement 200 nm). Brièvement, cette technique repose sur la superposition de deux lasers : le premier consiste à exciter un volume de l’échantillon tandis que le second (décalé vers le spectre des longueurs d’onde « rouge ») excite la périphérie du volume pour « éteindre » la fluorescence par émission stimulée. Sur le SP8, ce second laser dit «de déplétion » peut être continu (592 nm) ou pulsé (775 nm). Il est courant de parler de donut pour se référer à la forme du faisceau de déplétion sur l’échantillon. En conséquence, le volume d’excitation de l’échantillon peut être réduit à un point focal dont la taille qui peut être réglée par l’intensité du laser de déplétion définit la résolution. Sur ce système en particulier, l'utilisation d'un laser de déplétion continue à 592 nm doit être combinée à une détection dite par fenêtre temporelle (en Anglais, gated detection) pour améliorer encore la résolution. Le microscope possède donc deux laser de déplétion qui peuvent être utiliser séquentiellement pour générer des images STED 3 couleurs si besoin. Notez que l'imagerie super-résolution STED requiert l’utilisation d’une puissance laser élevée pour induire une émission stimulée ce qui peut endommager les échantillons. Enfin cette technique nécessite une préparation en amont : un milieu de montage spécifique et l’utilisation de certains fluorochromes afin d’améliorer l'efficacité de l'imagerie STED.
Pour plus d’informations sur cette technique, nous vous recommandons les liens suivants: iBiology STED, Leica STED3X et Leica sample preparation recommendation.

Échantillons recommandés : Échantillons fixes et vivants, Imagerie confocale rapide, Imagerie haute-résolution.

Pour plus d’information, n’hésitez pas à contacter les membres de la plateforme Neurimag.

Retour

Zeiss LSM880 - Elyra PS1

Système de microscopie inversée qui peut être utilisé comme un microscope Confocal à balayage laser (mode de détection Airyscan disponible) ou un microscope plein champ (illumination laser en epifluorescence, HiLo ou TIRF) permettant d’accéder aux techniques de super-résolution SIM (Structured Illumination Microscopy) et PALM/dSTORM 3D (PhotoActivated Localization Microscopy / direct STochastic Optical Reconstruction Microscopy).

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES

Amélioration de la résolution spatiale pour l’imagerie confocale en utilisant le mode de détection Airyscan. L’option Fast Airyscan est disponible pour l’imagerie confocale rapide sans compromis sur la résolution spatiale.
En plus de l’imagerie confocale, le système peut également proposer de l’imagerie plein champ, HiLo et TIRF. Les filtres d’émissions disponibles sont décrits ici.
Le maintien du focus est disponible en utilisant la fonction Definite Focus.
Un incubateur sur platine (Tokai Hit ELYX-SET) pour le contrôle de la température comprenant également un mixeur de CO² digital est disponible pour les expériences sur échantillons vivants sur demande auprès du personnel Neurimag.
Le microscope est piloté par le logiciel Zen Black (version 2.3 SP1) et les images acquises avec le mode de détection Airyscan peuvent être traitées en parallèle sur la station de travail 2 avec le logiciel Zen Blue.

FONCTIONNALITÉES AVANCÉES

En plus d’une imagerie confocale rapide et plein champ (epifluorescence, HiLo, TIRF), les expériences nécessitant l’utilisation de techniques de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching ou Redistribution de fluorescence après photoblanchiment), de FRET ratiométrique (Fluorescence / Förster Resonance Transfer Energy ou Transfert d’énergie par resonance de type Förster) et de Raster-scan Image Correlation Spectroscopy (analyse des fluctuations de fluorescence) peuvent également être réalisées sur ce système. L'imagerie en mode Multi-position et Tile Scan sont également disponibles.

OBJECTIFS DISPONIBLES

* à utiliser pour l’imagerie de super-résolution PALM. Nécessite également des lamelles de 0.17 mm et une huile à immersion particulière.

LASERS

FILTRES DICHROÏQUES POUR L’OBSERVATION ET L’ACQUISITION

Pour l’observation (aux oculaires):

- Un filtre passe-bande triple (Filter set 25 HE)

Pour l’acquisition (plein champ et imagerie super-résolution):

* BP 495-550 / LP 750 est disponible;
** BP 570/620 / LP 750 est disponible

BP: filtre passe-bande, LP: filtre passe-haut, LBF: filtre passe-bande multiple

DÉTECTION

TECHNIQUE DE SUPER-RESOLUTION

Les microscopies SIM et PALM/STORM sont deux techniques dites de super-résolution permettant d’atteindre des résolutions spatiales en-deça de la limite de diffraction. Une liste non-exhaustive de publications faisant appel aux techniques de super-résolution sur le système de microscopie Zeiss LSM880 – Elyra PS.1 est disponible ici.

L’imagerie super-résolutive SIM repose sur l’utilisation d’une illumination structurée afin de générer des franges de Moiré permettant d’extraire les informations super-résolutives (haute fréquence spatiale) de l’échantillon. Brièvement le principe consiste à exciter un échantillon fluorescent avec un motif d’illumination bien défini spatialement (une grille est placée le long du trajet optique d’excitation, plus précisément sur un plan image intermédiaire). Ce motif d’illumination interagit avec le motif d’émission de l’échantillon fluorescent, générant alors des franges de Moiré. La particularité de ces franges repose sur leur fréquence spatiale plus basse que celles des structures originales de l’échantillon. Ces franges de Moiré vont en quelque sorte « rétrograder » les informations à haute fréquence spatiale de l’échantillon vers des fréquences plus basses qui sont alors transmissibles à travers l’objectif. En imageant ces interférences (déplacement de la grille sur 3 à 5 positions de phases et 3 rotations angulaires), il est alors possible de reconstruire une image dont la résolution spatiale est grandement améliorée (environ 1.4 à 2 fois par rapport à la microscopie confocale). Cette technique ne nécessite pas de méthode de préparation d’échantillon spécifique ainsi que de fluorophores particuliers. Néanmoins, l’imagerie super-résolution SIM n’est pas optimale pour des échantillons épais ou densément marqués en fluorescence.

Pour plus d’informations sur la technique de super-résolution SIM, consultez les pages iBiology SIM et Zeiss SR-SIM.

L’imagerie super-résolutive PALM/STORM consiste à (photo-)activer de manière stochastique des molécules fluorescentes de propriétés photochimiques connues, à les détecter et à les localiser de manière individuelle avec une grande précision en 3D. A chaque (photo-)activation, seule une proportion de molécules fluorescentes se retrouve à l’état excité. La répétition de ces évènements d’activation permet au final de reconstituer pas à pas la localisation de chaque molécule et ainsi de reconstruire une image dont la résolution spatiale est grandement améliorée (20-50 nm en XY et 50-100 nm en Z*). La technique de PALM s’appuie sur l’utilisation de sondes spécifiques, et notamment de sondes photo –activable, –convertible ou encore –switchable. La technique de STORM repose sur l’utilisation de sondes organiques (Alexa647, Cy3, Cy5, …) et de tampons aux propriétés oxydo-réductrices.

Pour plus d’informations sur la technique de super-résolution PALM/STORM, consultez les pages iBiology PALM et iBiology STORM.
* L’amélioration de la resolution axiale repose sur la méthode de “double phase ramp”. Plus de détails ici.

AUTRES

La plateforme d’imagerie Neurimag met à votre disposition des chambres adaptées pour l’imagerie avec des échantillons vivants.

Échantillons recommandés : Échantillons fixes et vivants, Imagerie confocale rapide, Imagerie haute-résolution, Imagerie plein champ, Imagerie super-résolutive SIM, Imagerie super-résolutive PALM/STORM

Pour plus d’information, n’hésitez pas à contacter les membres de la plateforme Neurimag.

Retour

Leica – Spinning disk X1

Voici les caractéristiques du microscope:

               - Illumination Top-hat (carré) : illumination/excitation homogène de votre échantillon

               - Jusqu’à 5 lasers dont un laser à 405, à 488, à 532, à 561 et à 633 nm (le laser à 730 nm n’est pour le moment pas utilisable).

               - Imagerie 2 couleurs rapide (W-View Gemini-2C, Hamamatsu). Ce module permet de séparer spectralement deux longueurs d’onde sur deux caméra sCMOS (Flash 4.0 v3, Hamamatsu). Le module sera optimisé pour le « vert-rouge ».

               - Enceinte thermostatée et Controleur CO² pour les expériences sur échantillons vivants.

Le système de microscopie Leica – Spinning disk X1 devrait comprendre un système de photomanipulation.

Retour

Zeiss Axioplan 2

Microscope droit en epifluorescence équipé d’une caméra CoolSnap (Roper Scientific) pilotée par MetaVue (Molecular Devices)

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES

Vérification rapide de vos marquages fluorescents (6 filtres d’émission sont disponibles)
Acquisition d’images fluorescentes (MetaVue)

OBJECTIFS DISPONIBLES

SOURCE LUMINEUSE

Lampe fluorescente HBO (100W) et Lampe HAL (100W)

FILTRES

En plus des filtres CFP et YFP :

DÉTECTION

Caméra monochromatique CoolSnap ES (Roper Scientific)

Retour

ZEISS WIDEFIELD SCANNER

Microscope plein-champs inverse équipé de deux cameras (mono-chromatique et couleurs), une platine motorisée XY, une illumination COLIBRI reposant sur des LEDs (7 lampes dont un 735/40 nm pour le rouge lointain) permettant un contrôle indépendant des puissances pour chaque LED et une série de porte-échantillons adaptée à tous les supports (lames, boites).

PRINCIPALES CARACTERISTIQUES

Interface logicielle conviviale et complete pour une utilization immediate.
Platine XY motorisée équipée de supports pour l’imagerie sur lames et/ou boites.
Deux caméras : Hamamatsu ORCA-Flash4LT et Zeiss Axiocam 305
Une source d’illumination COLIBRI 7 (385, 430, 475, 555/590, 630 and 735 nm) et 5 filtres passe-bande à l’émission (425/30, 514/30, 592/25, 681/45, 788/38).
Le module AI Sample Finder pour une détection et définition automatique des contours de vos échantillons biologiques
De nombreux objectifs allant de 2.5x à 63x (dont un 63x huile-immersion)

FONCTIONNALITEES AVANCEES

Le microscope plein-champs Zeiss possède de nombreuses fonctionnalités dédiées à faciliter la réalisation de mosaïques sur tout type de supports pour vos échantillons biologiques. La source d’illumination COLIBRI permet un contrôle indépendant des intensités d’illumination. Le module AI Sample Finder est intégré au système, et permet de détecter et définir le contour de vos échantillons biologiques afin d’être envoyé vers le module Mosaïque.

Retour

Bruker VUTARA 352

Le microscope Bruker VUTARA 352 est un microscope inversé équipé pour le 3D dSTORM, le PALM, le PAINT ou le suivi de molécule unique (trajectoire de récepteur ou de molécule d’adhésion) avec six raies laser de très haute puissance (405, 488, 561, 640, 750) et deux caméras (caméra sCMOS (4 MP, Taille de pixel de 6,5 µm x 6,5 µm pour l'imagerie en super résolution ; Caméra CCD (1392 x 1040 pour l'imagerie à grand champ) permettant une microscopie multi-couleurs en super résolution sur des échantillons épais (jusqu'à 8 microns). Il est couplée à un microscope OPTERRA équipé permettant une illumination rapide (pinhole circulaire ou en ligne) et d'une caméra Hamamatsu EMCCD, permettant la microscopie corrélative avec l'imagerie en mosaïque tissulaire, ou l'imagerie d'échantillons vivants.

PRINCIPALES CARACTÉRISTIQUES

Le système dispose d’une Interface utilisateur améliorée pour l'imagerie 3D STORM : le logiciel SRX vous permet de visualiser directement pendant l’acquisition, votre reconstruction de molécule unique en 3 dimension. Elle peut être corrélée avec une image en champ large, ou à une image mosaïque ou encore a des images provenant de champ balayé très rapidement (OPTERRA). Il peut acquérir un échantillon en 3D (via une platine piézo Z de haute précision (100 µm) et dans le temps (volume 20 µm x 10 µm x 1 µm jusqu'à 3 000 fps pour le suivi des particules 3D).

OBJECTIFS DISPONIBLES

Objectif Olympus à immersion à eau: 60x, ouverture numérique: NA=1,2.
Objectif Olympus à immersion à Silicone: 60x ouverture numérique NA=1,3.

LASER

Lasers disponibles 100 mW: 405 nm;
1000 mW: 488 nm, 561 nm, 640 nm, 750 nm

ENVIRONNEMENT CONTROLE

Le système est équippé d’un dispositif de régulation de la température pour l’imagerie du vivant.

Stations de travail

Station de travail 1
Ordinateur Dell, écran 24 pouce

Configuration:
Windows 7 Professional 64bits, Intel Core i7-2700k 3.50 GHz
AMD Radeon R9 380, 32 GB RAM
2 x 128 GB SSD (boot, RAID 0) et 2x1.5 TB SATA rpm

Logiciels disponibles:
Volocity, Neurolucida, Icy, FiJi, Pack Office

Station de travail 2
Ordinateur HP Z820, écran 22 pouces

Configuration:
Windows 7 Ultimate 64bits, 2x Intel Xeon E5-2643 Quad Core 3.30 GHz
AMD FirePro V5900 2 GB graphic card, 8 x 8 GB RAM
256 GB SSD (boot) et 2x2 TB SATA 7200 rpm (formatés comme un disque dur 4 TB RAID 10)

Logiciel disponibles:
Icy, Fiji, Zen Blue pour les images Airyscan (Zeiss LSM 880 – Elyra PS.1)

Retour

Services additionnels

Chambres pour la microscopie

Diamètre de 55 mm

Adaptée pour des lamelles de verre rondes de 18 mm

2 pièces métalliques aimantées, 1 joint en silicone, 1 tuyau en silicone pour la perfusion (Ø 2 mm)

Diamètre de 35 mm

Adaptée pour des lamelles de verre rondes de 18 mm

2 pièces métalliques aimantées, 1 lame ronde couvre-objet, 1 joint en silicone

Analyse et traitement d’images et de données
L’équipe Neurimag peut vous aider dans vos analyses et vos traitements d’images.
Pour plus d’information, n’hésitez pas à contacter les membres de la plateforme Neurimag.

Préparation de vos échantillons
La plateforme Neurimag met à votre disposition une pièce pour préparer vos échantillons. Vous y trouverez tous les consommables de laboratoire nécessaires ainsi qu’une hotte stérile et un incubateur à 37°C (et 5% CO₂).
Pour plus d’information, n’hésitez pas à contacter les membres de la plateforme Neurimag.

Retour

Le service de culture primaire de NeurImag est un service unique de préparation d'échantillons biologique en Ile de France. Nous fournissons des cultures de neurones, d’astrocytes et de microglies maintenus jusqu’au stade d’utilisation.
Les cellules peuvent être récupérées dès la fin de la préparation pour être ensemencées dans vos laboratoires ou entretenues par notre service pour des projets en partenariat avec le service d'imagerie.

Les prestations sont ouvertes aux équipes internes et externes à l’Institut de Psychiatrie et Neurosciences de Paris.

Les demandes de prestations techniques s’effectuent après une réunion scientifique avec les membres de la plateforme NeurImag et via le système de réservation sur l’intranet.

Le service de culture s’assure de la qualité des cellules jusqu’à récupération des cellules par les utilisateurs ayant passé commande.

Toutes les prestations du service de culture primaire (cultures de neurones, transfection et culture de cellules gliales) se font exclusivement dans les laboratoires de confinement 2 de l’IPNP.

Toutes les prestations fournies sont facturées de façon trimestrielle en même temps que le reste de la plateforme. Les tarifs sont disponibles ICI

Pour plus d’information, n’hésitez pas à contacter les membres de la plateforme NeurImag.

Prestations

Nous proposons plusieurs prestations techniques :

• Culture hebdomadaire de neurones primaires d’hippocampe, de cortex et cellules gliales (Astrocytes + microglies)

Les demandes de cellules primaires doivent être formulées avant vendredi 10h pour avoir des cellules le mardi suivant via le système de réservation intranet.

L’utilisateur est seul responsable des cellules après la livraison et des problèmes liés à l’ensemencement.
Le milieu adéquat pour maintenir les cellules peut être fourni par le service

Pour des projets collaboratifs intégrant des prestations d'imagerie NeurImag, les cellules peuvent être ensemencées et maintenues jusqu'à leur utilisation par le service de culture primaire.
Les supports adaptés aux microscopes de la plateforme NeurImag (lamelles de verre Menzel 18mm de type 1.5 ou boites à fond de verre 35mm) sont aussi proposés par le service.

• Transfection lipofectamine

Les transfections sont réalisées avec la lipofectamine 2000 et le plasmide de l’utilisateur sur des cultures de neurones à différents stades (DIV7 à DIV 14).

D’autres techniques peuvent être mise en place, merci de prendre contact avec la plateforme NeurImag.

• Fixation PFA et Immunomarquage

La plateforme fournit les consommables telles les solutions de fixation (PFA 4%) et de blocage. Les anticorps sont à apporter par les équipes.

Ces prestations se font dans le cadre d’un projet collaboratif. Merci de prendre contact avec la plateforme NeurImag.

Institut de Psychiatrie et Neurosciences de Paris
INSERM U1266
102-108 Rue de la Santé 75014 PARIS
https://ipnp.paris5.inserm.fr
Tel : 01.40.78.92.01

Chartes NeurImag - Règles et Procédures

(En application à partir du 01 Avril 2019)

Introduction
Règles générales d’accès à NeurImag
Systèmes disponibles
Prestations disponibles culture cellulaire primaire
Procédure de Formation
Procédure de Réservation du service d'imagerie
Sauvegarde des données
Règles d’utilisation du matériel
Hygiène et sécurité
Procédure de Réservation du service de Culture cellulaire Primaire
Systèmes et salles
Confidentialité des données
Mention de la plate-forme dans les publications

1. Introduction

Bienvenue sur la plate-forme d’imagerie de l’Institut de Psychiatrie et Neurosciences de Paris NeurImag

NeurImag est l’un des quatre plateaux techniques de l’Institut de Psychiatrie et Neurosciences de Paris (IPNP), localisé dans le 14^ième arrondissement de Paris. Il évolue en collaboration directe avec l’INSERM, l’Université Paris Descartes et l’Hôpital Sainte-Anne.

La plateforme NeurImag propose deux types d’activités :

Le service de culture primaire de neurones permettant ainsi aux utilisateurs d’avoir les échantillons biologiques sur place.

Les utilisateurs de NeurImag, une fois autorisés et formés par notre équipe, pourront librement utiliser les différents systèmes.

L’accès à la plate-forme implique l’acceptation des règles et procédures définies par la plate-forme et validées par le comité de direction de l’IPNP.

2. Règles générales d’accès à NeurImag

2.1. Localisation

NeurImag est localisé au deuxième étage de l’IPNP, 102-108 rue de la santé, 75014, Paris

2.2. Accès

→ Métro ligne 4 : Arrêt Alésia
→    Métro ligne 6 : Arrêt Glacière
→    Tramway ligne 3 : Arrêt Cité Universitaire
→    RER B : Arrêt Cité Universitaire
→    Bus n°21 : Arrêt Glacière Tolbiac
→    Bus n°62 : Arrêt Glacière Tolbiac
→    Bus n°88 : Arrêt Glacière Tolbiac
→    Bus n°216 : Arrêt Glacière Tolbiac
→ Bus Orly-bus : Arrêt Glacière Tolbiac

2.3. Horaires d’accès

L’accès des utilisateurs externes est autorisé de 9h à 17h30 du Lundi au Vendredi. Pour les agents de l’IPNP les horaires sont déterminés par les règles d’accès à l’IPNP, à savoir du Lundi au Vendredi de 8h00 à 20h00. En cas d’accès à des horaires différents, les weekends et jours fériés, les utilisateurs doivent faire une demande de présence en horaires décalés et signaler leur présence dans le cahier de dépassement d’horaires, disponible au bureau d’accueil de l’IPNP.

3. Systèmes disponibles

Les systèmes suivant sont disponibles à l’utilisation :

→ Station d’analyse de données 1
→ Station d’analyse de données 2
→ Station d’analyse de données 3
→ Microscope à fluorescence Zeiss Axioplan 2
→ Microscope Spinning disk
→ Microscope Leica TCS SP5
→ Microscope Leica TCS SP8
→ Microscope Zeiss LSM 880
→ Microscope STORM BRUKER Vutara

Les détails techniques de ces systèmes sont disponibles sur le site internet de l’IPNP

NeurImag met à disposition 6 laboratoires de confinement 2, dont une salle de travail au 2eme étage dédiée spécifiquement à l'activité de prestations du service de culture cellulaire primaire.

Les laboratoires de confinement 2 sont équipés de :

PSM de type II MSC Advantage 1.2 (2016) certifié NF
Centrifugeuse réfrigéré SL16R (2016) munis de gobelets pour tubes 15mL et 50mL avec couvercles
Incubateurs Thermo Scientific HERAcell® 150i
Microscope Leica DM IL Led
Combiné réfrigérateur / congélateur
Micropipette F1 Thermo Scientific
PipetAids S1 Thermo Scientific

4. Prestations disponibles culture cellulaire primaire

Les prestations en culture cellulaire disponibles sont les suivantes :
→ Neurones hippocampe
→ Neurones cortex
→ Lamelles + coating PDL + neurones (hippocampe ou cortex)
→ Coating PDL seul
→ Transfection
→ Immuno-marquage
→ Milieu conditionné

4.1. Facturation

Le détail des conditions de facturation est disponible sur le site internet de l’IPNP

5.Procédure de Formation

5.1 Informations générales

Au préalable de toute formation, une demande doit être faite via le formulaire en ligne. La charte d’utilisation de la plate-forme devra être co-signée par l’utilisateur et son responsable d’équipe. Si un membre d’une équipe est responsable d’une « casse » de matériel de la plateforme, l’équipe en question devra payer le prix nécessaire à sa remise en état.

Afin de s’assurer de la bonne utilisation des systèmes, il est recommandé de procéder à la formation seulement une fois votre projet de recherche clairement défini.

La formation sera facturée au prix d’une heure d’utilisation du système en question.

Les utilisateurs sont invités à contacter notre équipe afin de s’assurer de la compatibilité de leurs expériences avec le matériel de la plate-forme.

5.2 Demande de Formation

Pour faire une demande de formation :

Accéder au formulaire de demande de formation disponible sur le site internet de l'IPNP.

Une fois le formulaire rempli et soumis à notre équipe, votre demande sera traitée dans les meilleurs délais. Vous recevrez ensuite un email de confirmation indiquant la date et le créneau horaire de formation proposé.

La plate-forme est ouverte aux utilisateurs externes. Ces derniers doivent préalablement soumettre une demande de collaboration via le formulaire en ligne.

En cas de problème lié à la demande de formation ou pour toute information complémentaire, contacter notre équipe par mail à neurimag.ipnp@inserm.fr

6. Procédure de Réservation du service d'imagerie

6.1 Informations générales

La réservation des systèmes est libre, cependant elle ne sera autorisée que si notre équipe est assurée de la capacité des utilisateurs à s’en servir.

Les utilisateurs ont la possibilité d’annuler tout créneau de réservation jusqu’à 24 heures avant le début du créneau. Passé ce délai, l’utilisateur devra envoyer une demande motivée à l’aide du formulaire spécifique disponible sur le site de l’IPNP.

Les créneaux de réservations sont maintenus jusqu’à 30 minutes après le début de l’horaire prévu. Au-delà de cette durée, si l’utilisateur n’est pas en train d’utiliser le système, la réservation est annulée et de nouveau disponible pour les autres utilisateurs. Le créneau sera tout de même facturé sauf si la plate-forme parvient à trouver un utilisateur pouvant exploiter le créneau en question.

6.2 Demande de réservation

Les utilisateurs désirant réserver une machine ou faire appel aux prestation de culture primaire sont priés de procéder à une réservation en ligne via le site Intranet de l’IPNP

L’accès Intranet étant réservé aux membres de l’IPNP, Les utilisateurs ne pouvant pas s’y connecter sont priés de contacter notre équipe à neurimag.ipnp@inserm.fr

7. Sauvegarde des données

Tous les systèmes de la plate-forme d’imagerie seront à terme reliés au réseau interne de l’IPNP. La sauvegarde des données devra donc se réaliser via ce réseau.

Afin de faciliter le stockage des données, pour chaque utilisation, les utilisateurs sont priés de sauvegarder leurs expériences dans un dossier « équipe » ainsi qu’un sous dossier « Prénom NOM ». Le fichier correspondant à l’expérience devra être du type « AAAA/MM/JJ + information descriptive ».

Afin d’éviter la saturation des disques durs des postes d’acquisitions, les utilisateurs sont priés d’exporter leurs données et de les stocker sur leur poste personnel. Ainsi le personnel de la plate-forme se réserve le droit, si nécessaire, de supprimer toute expérience stockée sur les disques durs des postes d’acquisitions ou de traitement d’images sans notification ni avertissement préalable.

Des interventions de sauvegarde de routine des données seront réalisées par l’équipe de la plate-forme après avoir avertis les utilisateurs et leur avoir laissé un délai d’intervention suffisant pour sauvegarder les données sur un support de stockage externe.

Les systèmes de la plateforme sont sauvegardés tous les jours. Aussi la plateforme NeurImag s’engage à stocker de manière sécuritaire toute donnée pendant une durée de 30 jours, passé ce délai, l’accès aux données n’est plus garanti.

8. Règles d’utilisation du matériel

8.1 Matériel informatique

Le personnel de la plate-forme est chargé de maintenir les systèmes dans un état de fonctionnement optimal, aussi ils peuvent à tout moment être amenés à intervenir et effacer une partie ou la totalité des disques durs. Ces interventions d’urgences seront faites sans notification ni avertissement préalable.

Les utilisateurs doivent utiliser les sessions utilisateurs des différents postes d’acquisition ou de traitement de données. Il leur est interdit d’installer, désinstaller ou procéder à des mises à jour de logiciels sans la permission expresse du personnel de la plate-forme.

Les utilisateurs ne sont pas non plus autorisés à consulter ou utiliser sans autorisation des fichiers ou données qui ne leur appartiennent pas.

8.2 Systèmes et salles

Les salles de la plate-forme sont maintenues à une température de 22°C grâce à un système de climatisation. Cette température est indispensable au bon fonctionnement des systèmes. Il est interdit aux utilisateurs de modifier cette température.

Les systèmes sous soumis à des tests réguliers de métrologie par le personnel de la plate-forme, les utilisateurs sont ainsi assurés que le matériel est en bon état de marche et que les données obtenues sont scientifiquement exploitables.

La bonne tenue de la station de travail lors de la manipulation est sous la responsabilité de l’utilisateur qui a réservé le créneau d’utilisation. Si un comportement pouvant mettre en cause l’intégrité des systèmes est constaté, le personnel autorisé de la plate-forme pourra examiner de manière détaillée le contenu des fichiers ainsi que l’historique de réservation et d’utilisation des stations afin d’interdire temporairement ou définitivement l’accès à l’utilisateur impliqué.

8.3 Consommables

Certains consommables sont mis à la disposition des utilisateurs, à savoir :
Papier optique
Huile à immersion
Mouchoir en papier
Solution de nettoyage des objectifs
Gants en latex
Poubelles pour matériels et échantillons contaminé
Lames de démonstration (sur demande)
Si un ou plusieurs de ces consommables sont manquants, les utilisateurs sont priés de s’adresser au personnel de la plate-forme.

9. Hygiène et sécurité

9.1 Matériel Informatique

Afin de garantir l’intégrité des systèmes informatiques de la plate-forme, nous demandons aux utilisateurs de ne pas introduire de clefs USB potentiellement infectées sur les postes d’acquisition.

La plate-forme d’imagerie ne saurait être tenue pour responsable de la transmission de virus informatiques et autres éléments nuisibles au bon fonctionnement du matériel informatique de la plate-forme.

9.2 Matériel biologique

Afin de garantir l’intégrité des systèmes et des personnes, nous demandons aux utilisateurs de ne pas introduire des cellules infectées vivantes ou de produits toxiques/pathogènes pour les cellules et êtres vivants. Les utilisateurs ne sont donc pas censés manipulés avec des gants, puisque le matériel biologique utilisé doit être de niveau 1. Les utilisateurs peuvent éventuellement introduire des échantillons préalablement infectés avec des virus non réplicatifs si ceux si sont fixés de manière à éviter toute contamination des systèmes. Les utilisateurs utilisant des échantillons humains susceptibles de contenir du prion (même fixé) doivent le signaler aux agents de la plateforme au préalable afin d’évaluer la faisabilité de l’imagerie. Nous vous conseillons de nous contacter, si vous avez le moindre doute sur la pathogénicité de vos échantillons. La plate-forme d’imagerie se réserve le droit d’exclure tout manipulateur ne respectant pas ces règles de sécurité.

10. Procédure de Réservation du service de Culture cellulaire Primaire

10.1 Conditions de commande

Les commandes de neurones devront être faites sur l’intranet de l’IPNP (https://ipnp.paris5.inserm.fr/) sur l’onglet « Réservation de Services » le vendredi avant 12h pour une livraison le mardi suivant. Afin de garantir un service de qualité, la concentration voulue sera à mentionner lors de la commande dans la boite de dialogue.

10.2 Conditions de prestations

Toutes les prestations du service de culture (cultures de neurones, transfection, test de molécules et culture de cellules gliales) se feront exclusivement dans le L2 du 2eme étage de l’IPNP. Les prestations du service de culture s’arrêtent dès que l’utilisateur récupère la commande.

Pour la culture de neurones, les cellules sont livrées en suspension dans un tube Falcon, il incombe à l’utilisateur d’ensemencer les neurones dans un laboratoire sous PSM et de changer le milieu. L’utilisateur est seul responsable des produits après la livraison et des problèmes liés à l’ensemencement.

Un contrôle de qualité est réalisé trimestriellement par le service afin de garantir le protocole de culture.

Si un problème de contamination est décelé dans 3 équipes différentes, aucune facturation ne sera faite. Dans le cas contraire, la livraison des neurones devra être acquittée par l’équipe.

Les prestations autres que la culture de neurones se feront après discussions avec les différents partenaires et seront conduites en étroite collaboration entre la plateforme NeurImag et l’équipe. Elles ne prendront fins qu’une fois les résultats remis à l’équipe.

10.3 Facturation des prestations

Les quantités de cellules variant d’une semaine à l’autre, la facturation ne se fera que sur ce qui a été délivré et inscrit sur le « Bon de livraison » inscrit le mardi au moment de la remise des neurones contre signature. Le service de culture ne pourra être tenu responsable de la non livraison de la commande due aux aléas de la culture de neurones. Celle ci ne sera pas facturée tant que la livraison n’aura pas été honorée.

10.4 Consommables au L2

La plateforme fournit les équipements de protections individuels (gants, blouse jetable, sur-chassure) ainsi que les produits d'entretien (Phagospray et papier). Les consommables plastiques sont à apporter par les utilisateurs. Un meuble dédié est mis à disposition dans le SAS.

11. Systèmes et salles

Les utilisateurs sont priés de respecter la propreté des systèmes et de les conserver dans un état tel qu’ils aimeraient les trouver en arrivant. Cette propreté peut être conservée par de simples règles de bon sens (liste non exhaustive) :

→ Nettoyer les objectifs à huile ou Immersion après utilisation.
→ Jeter les produits à risques biologiques dans les poubelles jaunes prévues spécifiquement à cet effet et mises à disponibilité sur la plate-forme.
→ S’assurer que les supports d’échantillons (lames, boites de pétri...) ne fuient pas.
→ Ne pas utiliser de gants d’expérimentation pour manipuler les ordinateurs ou microscopes.
→ Contacter le personnel de la plate-forme ou la personne responsable hygiène et sécurité en cas de problème.

Pour des raisons d’hygiènes et sécurité évidentes, tout matériel sensible (lame, boite de pétri, boite de culture…) oublié sur une station de travail sera immédiatement jeté sans avertissement ni notification préalable par le personnel de la plate-forme.
L'entretien des laboratoires de confinement 2 incombe aux utilisateurs et suit les bonnes pratiques de laboratoire et le respect des règles en vigueurs au sein de l'IPNP pour l'évacuation des déchets biologiques.

12. Confidentialité des données

Les images et données obtenues grâce aux systèmes de la plate-forme d’imagerie sont la propriété des équipes qui les ont réalisés ainsi que de l’INSERM et obéissent en tous points aux règles et usages relatifs à la propriété intellectuelle.

Les membres de la plate-forme ne sont d’ailleurs pas autorisés à communiquer sur les thèmes de recherche des utilisateurs sans l’accord des équipes.

Si la confidentialité des données est requise, nous recommandons aux utilisateurs de ne stocker leurs données ni sur le réseau ni sur les postes d’acquisition ou de traitement d’image. Il est dans ce cas préférable de stocker les données sur CD.

13. Mention de la plate-forme dans les publications

13.1 Généralités

La mention de la plate-forme ou de ses agents dans des publications permet de mettre en évidence leur utilité et le bienfondé de leur présence dans la communauté scientifique. Ceci facilite d’autant la demande de financement pour investir dans nouveaux appareils et de nouvelles ressources.

13.2 Mention de la plate-forme

Le nom de la plate-forme technologique devra être cité dans toute publication incluant des données obtenues grâce à ses systèmes. Cette citation peut par exemple figurer dans les matériels et méthodes ou dans les remerciements : « We acknowledge NeurImag facility of the Institute of Psychiatry and Neuroscience of Paris where imaging experiments were carried out»

13.3 Mention du personnel

En cas d’implication dans un projet collaboratif, le ou les agents NeurImag impliqués seront inclus dans les auteurs de toute publication résultante de ces travaux.

Hors du contexte de la collaboration, les utilisateurs ne sont en aucun cas tenu d’inclure les agents de la plateforme dans la liste des auteurs d’une publication. Toutefois, s’ils estiment que le travail d’un ou plusieurs membres de la plate-forme a été essentiel pour l’obtention des résultats, le choix d’intégrer cette ou ces personnes dans la liste des auteurs est laissé à leur jugement.

Nom et prénom, suivi de la date et signature

La plateforme NeurImag fait partie du Consortium UP³des Plateformes Photoniques de l’Université de Paris (Université de Paris Photonic Platform)

Missions

Le consortium des plateformes de l’Université de Paris UP³ a pour mission d’offrir son expertise, de former et de mettre à disposition des chercheurs les équipements et l’expertise nécessaires à la réalisation de projets d’imagerie en microscopie à fluorescence. Il est totalement ouvert et accessible non seulement aux équipes des sites de l’Université de Paris, mais aussi aux utilisateurs externes, qu’ils soient du monde académique ou privé. Ce consortium a pour but d’orienter les utilisateurs sur les sites les plus adaptés en fonction de leur problématique et de rationaliser les choix lors de l’achat de nouveaux équipements, afin d’optimiser les services disponibles.